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本试剂盒适用于血清（浆）、各种组织匀浆液、中性白细胞、某些药物、部分植物、培养细胞、培养上清液等的羟自由基活力测定。


Fenton反应是最常见的产生羟自由基的化学反应，H₂O₂的量和Fenton反应产生的·OH量成正比，当给予电子受体后，用griess试剂显色，形成红色物质，其呈色与·OH的多少成正比关系。

• 快速简便：全程约2分钟，可测48例左右样本。
  
• 稳定性好：试剂盒2～8℃存放3个月有效。
  
• 再现性好：变异系数CV=1.4%。
  
• 回收试验：X =98%。
  
• 受外界影响因素小：干扰因素少，重复性强。

可以观察机体的抗氧化能力强弱（测定血清/血浆及体液等）以及观察植物组织的氧合作用，并且可用于体外筛选抗活性氧效能强的食品、营养素、中草药、西药等。

组分	规格
试剂一：3% H2O2标准品贮备液	0.5mL
试剂二：底物贮备液	1mL
试剂三甲液贮备液	2mL
试剂三乙液	2×7mL
试剂四	10mL
试剂五	30mL
试剂六	30mL

保存：4℃避光，有效期3个月。

• 分光光度计/酶标仪/半自动生化分析仪（比色测定波长为550nm）
  
• 恒温水浴箱或气浴箱（孵育温度为37℃）
  
• 漩涡混匀器
  
• 微量移液器
  
• 分析纯冰醋酸、双蒸水等

• 0.03%标准品应用液的配制：
  按3% H₂O₂标准贮备液:双蒸水＝1:99比例稀释，现用现配。
  
• 底物应用液：
  
  • 若您的样本为抑制羟自由基，即测定管吸光度比对照管吸光度低，则按以下比例现用现配：
    底物贮备液:双蒸水＝1:99稀释
    注：抑制羟自由基的物质如：血清（浆）、各种组织匀浆液、口服液等。
    
  • 若您的样本为产生羟自由基，即测定管吸光度比对照管吸光度高，则按以下比例现用现配：
    底物贮备液:双蒸水＝1:299稀释
    注：产生羟自由基的物质如：中性白细胞、某些药物、部分植物。
  
  
• 试剂三甲液应用液：
  试剂三甲液贮备液用时加双蒸水1:9稀释成甲液应用液。
  
• 试剂三应用液：
  甲液应用液与乙液等比例混合，按需配制，余下4℃保存。
  
• 试剂四应用液：
  试剂四用时加双蒸水稀释至100mL，制备成应用液，4℃保存。
  注：若有结晶，则放置37℃水浴至全部溶解后再稀释。
  
• 显色剂：
  按下面比例现用现配：
  试剂四应用液:试剂五:试剂六:冰醋酸酸＝8:3:3:2。

• 必须每一只管子单独做，并且反应时间一分钟一定要准确。
  
• 必须严格按照操作表顺序加试剂，不可配置混合试剂。
  
• 检测样本溶解或介质可为生理盐水、双蒸水，但不能为磷酸缓冲液、无水乙醇等。
  
• 此方法检测灵敏度高，检测血清（浆）和组织以外样本时，最好先取原液及不同浓度稀释后的样本，例如5倍稀释液或10倍稀释液做预试。如测定管颜色太浅可将样本用其溶剂继续稀释至颜色较深为止。我司曾检测花粉的水提液的羟自由基，将其原液稀释150倍后，显色较好。

• 以上配制好的应用液，先在37℃水浴中预温3分钟，按下表加入各成分。
  

  成分	空白管	标准管	对照管	测定管
  双蒸水(mL)	0.4	0.2	0.2	-
  0.03% H2O2标准应用液(mL)	-	0.2
  底物应用液(mL)	-	-	0.2	0.2
  样本(mL)*	-	-	-	0.2
  试剂三应用液(mL)	0.4	0.4	0.4	0.4

  
  注^*：参考取样量，血清（浆）样本用生理盐水20倍稀释后取0.2mL做检测；若您有精确微量移液器，可直接取0.01mL血清（浆），再加0.19mL生理盐水。组织匀浆上清，取0.2mL检测。具体取样量需您自己做预试确定，详细预试方法见附录Ⅰ。
  
• 混匀，37℃反应1分钟（准确以秒表计时）。
  
• 立即加入显色剂2mL
  注：从加完试剂三开始到1分钟结束，立即加入显色剂2mL终止反应，一次只能做一支管子。
  
• 混匀，室温放置20分钟，波长550nm，1cm光径，双蒸水调零，测定各管吸光度值。

一、血清（浆）中抑制羟自由基能力的计算：

• 定义：
  规定每毫升血清（浆）在37℃下反应1分钟，使反应体系中H₂O₂浓度降低1mmol/L为一个抑制羟自由基能力单位。
  
• 公式：
  

  抑制羟自由基能力 (U/mL)	＝	OD对照－OD测定	×	标准品浓度 (8.824mmol/L)	×	1mL	×	样本测试前 稀释倍数
  		OD标准－OD空白				取样量

  
  
• 举例：
  取用生理盐水20倍稀释后的血清0.2mL检测抑制羟自由基能力，测定对照管吸光度OD值为0.785，测定管吸光度OD值为0.464，标准管吸光度OD值为0.443，空白管吸光度OD值为0.003，标准品H₂O₂浓度为8.824mmol/L，则计算如下：
  抑制羟自由基能力
  

  抑制羟自由基能力 (U/mL)	＝	0.785－0.464	×	8.824	×	1	×	20	＝643.75U/mL
  		0.443－0.003				0.2

二、组织中抑制羟自由基能力的计算：

• 定义：
  规定每毫克组织蛋白在37℃下反应1分钟，使反应体系中H₂O₂浓度降低1mmol/L为一个抑制羟自由基能力单位。
  
• 公式：
  

  抑制羟自由基能力 (U/mgprot)	＝	OD对照－OD测定	×	标准品浓度 (8.824mmol/L)	÷［	待测样本蛋白浓度 (mgprot/mL)	×	取样量 (0.2mL)	］
  		OD标准－OD空白

  
  
• 举例：
  取5%小鼠肝组织匀浆0.1mL用生理盐水10倍稀释成0.5%肝匀浆，取0.2mL检测，测得对照管OD值为0.785，测定管OD值为0.347，标准管OD值为0.443，空白管OD值0.003，标准品浓度为8.824mmol/L，0.5%小鼠肝匀浆的蛋白浓度为0.486mg/mL。
  

  抑制羟自由基能力 (U/mgprot)	＝	0.785－0.347	×8.824÷(0.486×0.2)＝90.37U/mgprot
  		0.443－0.003

三、溶血液中抑制羟自由基能力的计算：

• 定义：
  规定每毫克血红蛋白在37℃下反应1分钟，使反应体系中H₂O₂浓度降低1mmol/L为一个抑制羟自由基能力单位。
  
• 公式：
  

  抑制羟自由基能力 (U/mgHb)	＝	OD对照－OD测定	×	标准品浓度 (8.824mmol/L)	×	1mL	×	样本测试前 稀释倍数	÷	血红蛋白浓度 (mgHb/mL)
  		OD标准－OD空白				取样量

  
  
• 举例：
  例1．取抗凝红细胞0.2mL加冷双蒸水0.8mL，旋涡混匀器充分混匀1分钟制得溶血液，同时测定血红蛋白为41.182mgHb/ml。取0.01mL溶血液加5.99mL双蒸水，充分混匀后取0.2mL按操作步骤进行检测，测得对照管OD值为0.785，测定管OD值为0.615，标准管OD值为0.443，空白管OD值为0.003，标准品浓度为8.824mmol/L，则计算结果为：
  

  抑制羟自由基能力 (U/mgHb)	＝	0.785－0.615	×	8.824	×	1	×600÷41.182＝248.36U/mgHb
  		0.443－0.003				0.2

  
  例2．取抗凝红细胞0.2mL加冷双蒸水0.8mL，旋涡混匀器充分混匀1分钟制得溶血液，同时测定血红蛋白为53.684 mgHb/ml。取0.01mL溶血液加5.99mL双蒸水，充分混匀后取0.2mL按操作步骤进行检测，测得对照管OD值为0.785，测定管OD值为0.304，标准管OD值为0.443，空白管OD值为0.003，标准品浓度为8.824mmol/L，则计算结果为：
  

  抑制羟自由基能力 (U/mgHb)	＝	0.785－0.304	×	8.824	×	1	×600÷53.684＝539.06U/mgHb
  		0.443－0.003				0.2

四、产生羟自由基能力的计算：

• 定义：规定每毫升或每毫克物质或每立方厘米内10⁶个细胞在本反应体系中使反应液中H₂O₂的浓度增加1mmol/L为一个产生羟自由基能力单位。
  
• 公式：
  

  产生羟自由基能力 (U/mL)	＝	OD测定－OD对照	×	标准品浓度 (8.824mmol/L)	×	1mL	×	样本测试前 稀释倍数
  		OD标准－OD空白				取样量

  
  
• 计算举例：
  某中药物质稀释10倍后取0.2mL检测，检测得到测定管OD值为0.621，对照管OD值为0.217，标准管OD值为0.443，空白管OD值为0.003，则计算如下：
  

  产生羟自由基能力 (U/mL)	＝	0.621－0.217	×	8.824	×	1	×10＝405.10U/mL
  		0.443－0.003				0.2

附录Ⅰ：羟自由基最佳取样浓度及最佳取样量摸索

一、样本前处理：
1、血清（浆）：用生理盐水将血清（浆）按1:1、1:4、1:9、1:19等稀释成一系列不同浓度的血清（浆）、
分别取不同浓度的血清（浆）0.2mL按血清（浆）的测定操作表进行检测。
2、组织匀浆、细胞、线粒体或细胞膜等组织：分别用生理盐水将组织匀浆液稀释成10%、5%、2%、1%、0.5%、0.1%等一系列不同浓度的组织匀浆，分别取不同浓度的组织匀浆0.2mL按组织的测定操作表进行检测。

二、操作步骤：（以血浆样本为例作最佳取样浓度摸索）

• 样本来源：正常组大鼠眼眶取全血，肝素抗凝取血浆进行测定。
  
• 样本稀释：用生理盐水将血浆按1:1、1:4、1:9、1:19、1:49、1:99稀释成一系列不同浓度的血浆，
  分别取不同浓度的血浆0.2mL按血清（浆）的测定操作表进行检测。
  
• 以上配制好的应用液，先在37℃水浴中预温3分钟，按下表加入各成分。
  

  成分	空白管	标准管	对照管	测定管
  双蒸水(mL)	0.4	0.2	0.2	-
  0.03% H2O2标准应用液(mL)	-	0.2
  底物应用液(mL)	-	-	0.2	0.2
  样本(mL)	-	-	-	0.2
  试剂三应用液(mL)	0.4	0.4	0.4	0.4

  
  
• 立即加入显色剂2mL
  注：从加完试剂三开始到1分钟结束，立即加入显色剂2mL终止反应，一次只能做一支管子。
  
• 混匀，室温放置20分钟，波长550nm，1cm光径，双蒸水调零，测定各管吸光度值。
  
• 预试结果：
  

  	对照	0.785	空白	0.003	标准	0.443
  稀释倍数	1:1	1:4	1:9	1:19	1:49	1:99
  吸光度值	0.105	0.132	0.188	0.408	0.677	0.741
  抑制率	86.59%	83.16%	76.01%	47.99%	13.71%	5.66%

  
  
• 结论：
  从上面的数据统计可以看出，抑制率在45%～55%之间的最佳取样浓度为1:19，即取1:19稀释正常组大鼠血浆0.2mL进行羟自由基正式检测。
  

  抑制率＝	OD对照－OD测定	×100%
  	OD对照

三、讨论：
在您进行正式检测之前，需要从每组中取2～3个样本进行上面的预实验，确定最佳浓度和最佳取样量；在保证抑制率在20%～50%之间的同时，每组之间也应该有所差异，如果您有疑问，则需要重新摸索最佳浓度和最佳取样量。
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